Histoire
Près de 300 ans se sont écoulés depuis la troisième croisade en Terre Sainte, et le combat d'Altaïr pour retrouver son honneur. Toujours à travers sa mémoire génétique, Desmond se retrouve maintenant en Italie durant la Rennaissance mais cette fois, pour aider les Assassins[8]. Cette époque est l'aube d'une nouvelle ère où des nouveaux courants de pensée, tels que l'Humanisme commencent à voir le jour, mais où aussi, les agitations politiques et les violentes rivalités familiales font rage. XVe siècle, c'est dans ce contexte qu'il incarne le héros de cet épisode : Ezio.
Ezio est donc un autre ancêtre de Desmond et un descendant d'Altaïr. Noble de Florence, il devient un Assassin pour venger la mort de son père, pendu sur une place publique et victime d'un complot des autres familles puissantes. C'est à partir de ce moment-là qu'il découvrira la tenue des Assassins cachée dans une malle. Afin d'éradiquer la corruption et restaurer son honneur familial, il étudiera les secrets d'un ancien codex laissé par son ancêtre. Pour ses alliés, il deviendra une force de changement, un justicier et un libérateur. Pour ses ennemis, il sera un chevalier noir, dédié à la destruction des tyrans oppressant les peuples d'Italie.
L'histoire de cet épisode est ainsi axée sur les conflits entre les différentes familles d'Italie, mais la lutte entre Assassins et Templiers, intrigue principale de la série, n'a pas pour autant été délaissée. En effet, après la dissolution de leurs ordres respectifs, ils ont été contraints d'agir dans l'ombre. Ils seront donc beaucoup plus discrets, mais toujours présents. L'histoire du jeu se déroulera sur 27 ans de la vie d'Ezio soit de 1476 à 1503.
Personnages principaux
Ezio Auditore da Firenze : ( « Firenze » étant le nom italien de la ville de Florence) est un jeune homme italien né dans une famille noble de Florence. Bien éduqué, et bien entraîné dans "l'art de la mort", Ezio est mystérieux et talentueux tout comme son ancêtre, mais a aussi un côté séducteur. Maître de ses émotions, il est capable de se mêler à n'importe quelle classe sociale. Trahi par de puissantes familles italiennes, il s'aventurera jusque dans des terres inconnues en quête de vendetta comme on le dirait là-bas. Cette forte volonté de vengeance et de justice le mènera à quelque chose de plus grand que ses ambitions personnelles.
Desmond Miles : est un jeune homme âgé de 25 ans, de nationalité américaine. C'est le personnage principal de toute la série. Dans le début du premier opus, le jeune homme est retenu prisonnier par la société Abstergo, qui l'a enlevé afin de se servir de lui et de sa mémoire génétique pour retrouver un trésor perdu depuis des siècles. Desmond est forcé de coopérer avec les scientifiques qui menacent de le plonger dans le coma pour l'« utiliser » malgré tout s'il n'entre pas volontairement dans l'Animus. Il est cynique pour cacher ce qu'il ressent et a une grande faculté d'observation.
Lucy Stillman : est une jeune scientifique travaillant pour Abstergo, et s'occupant de l'Animus et du projet qui l'entoure. Elle est chargée surtout de la maintenance et du fonctionnement de la machine. Lucy explique au cours d'une conversation avec Desmond qu'elle a travaillé sur la mémoire génétique au cours de ses études, qu'elle en a fait une thèse mais que la communauté scientifique ne l'a pas prise au sérieux. Alors qu'elle craignait de devoir ranger ses travaux, Abstergo est venu la trouver pour lui proposer de participer au projet Animus. À travers plusieurs discussions entre Lucy et Desmond, ce dernier comprit assez vite qu'elle est de son coté, de par les informations qu'il a recueilli par lui-même et ce qu'elle lui a fait comprendre.
Personnages secondaires
Léonard De Vinci : sera un allié proche de la famille Auditore, et également l'ingénieur personnel d'Ezio. Il lui procurera toutes sortes d'inventions comme les deux lames secrètes ou encore la machine volante.
Nicolas Machiavel : sera le conseiller tactique du héros. Il serait également le chef des mercenaires à Florence.
Laurent de Médicis : deviendra un allié d'Ezio au cours du jeu. Son assassinat manqué y figurera également.
Catherine Sforza : apparaîtra dans le jeu. Cependant, des détails supplémentaires n'ont pas encore été révélés.
Giovanni Auditore da Firenze : est le père d'Ezio. Son métier est banquier mais il semblerait que c'est lui qui ait transmis à son fils le sang des Assassins, étant au courant du pouvoir étrange d'Ezio: la "vision d'aigle" (6e sens que pouvait utiliser Altaïr afin de distinguer l'intention des gens).
Mario Auditore da Firenze : est l'oncle d'Ezio (et le frère de Giovanni). Il l'aidera à s'améliorer dans ses aptitudes au combat au début du jeu. C'est la tête des mercenaires qui combattent les Templiers intégrés parmi les nobles locaux.
Paula : s'occupe des courtisanes (prostituées) de Florence. Elle est née d'une famille d'Assassins, mais ses parents meurent alors qu'elle n'a que 8 ans. Sans famille et dans la rue, elle devient une belle adolescente qui utilise son charme à ses fins. Mais elle est emprisonnée et violée par un garde florentin corrompu pendant des années jusqu'à ce qu'elle se libère en tuant son geôlier. Un Assassin informé par cet évènement la recueille à nouveau dans le clan. Après celà, elle commença son "entreprise" en accueillant les femmes florentines dans le besoin pour leur fournir un foyer. Elle est décidée à aider Ezio avec qui elle va se venger contre les personnes qui ont gâché sa vie.
Antonio : est le chef de la guilde des Voleurs. Il vit dans les quartiers commerciaux de Venise. Issue d'une famille pauvre, son père était un cordonnier, et sa mère une servante dans une famille de classe plus élevée. Il vivait une vie honnête, mais n'était pas satisfait de sa situation. Il travailla et étudia durement, mais aucune école ne l'acceptait et le dur labeur ne lui permettait pas de sortir de la misère. Il décida donc de prendre pour obtenir, et de se faire une figure dans le marché noir si il ne pouvait pas dans la société normale. Lui et son clan choisissent ses proies qui sont pour lui les nobles immoraux de la ville, et ne s'en prend pas aux citoyens ordinaires. Il considère sa guilde comme une affaire, et ça n'a rien d'une bande de voleurs, mais plutôt à l'échelle d'une organisation mafieuse. Il trouve en Ezio l'homme qui va lui permettre de gagner cette "guerre" contre les hommes corrompus de Venise.
Rosa : est une membre de la faction des Voleurs d'Antonio.
Shaun Hastings : est un historien qui assiste Desmond. D'après l'acteur qui prête son visage et sa voix dans la version originale, Danny Wallace, il est souvent à côté de l'ordinateur en train de donner des informations sur l'histoire de la Renaissance italienne, d'une manière un peu sarcastique parfois.
Carno Grimaldi : est un homme puissant et important de Venise. C'est une des cibles à assassiner d'Ezio.